【基因芯片技術(shù)】基因芯片的原理 基因芯片的分類

基因芯片(genechip)（又稱DNA芯片、生物芯片）的原型是80年代中期提出的?；蛐酒臏y(cè)序原理是雜交測(cè)序方法，即通過(guò)與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探針。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對(duì)應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補(bǔ)匹配時(shí)，通過(guò)確定熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的探針位置，獲得一組序列完全互補(bǔ)的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列。

基因芯片的原理

基因芯片(gene chip)的原型是80年代中期提出的?；蛐酒臏y(cè)序原理是雜交測(cè)序方法，即通過(guò)與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對(duì)應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補(bǔ)匹配時(shí)，通過(guò)確定熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的探針位置，獲得一組序列完全互補(bǔ)的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列。

基因芯片又稱為DNA微陣列(DNA microarray)，可分為三種主要類型：1）固定在聚合物基片（尼龍膜，硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標(biāo)記的靶基因與其雜交，通過(guò)放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是所需檢測(cè)設(shè)備與目前分子生物學(xué)所用的放射顯影技術(shù)相一致,相對(duì)比較成熟。但芯片上探針密度不高，樣品和試劑的需求量大，定量檢測(cè)存在較多問(wèn)題。2）用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣列，通過(guò)與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測(cè)。這種方法點(diǎn)陣密度可有較大的提高，各個(gè)探針在表面上的結(jié)合量也比較一致，但在標(biāo)準(zhǔn)化和批量化生產(chǎn)方面仍有不易克服的困難。3）在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列,與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測(cè)。該方法把微電子光刻技術(shù)與DNA化學(xué)合成技術(shù)相結(jié)合，可以使基因芯片的探針密度大大提高，減少試劑的用量，實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和批量化大規(guī)模生產(chǎn)，有著十分重要的發(fā)展?jié)摿Α?

它是在基因探針的基礎(chǔ)上研制出的，所謂基因探針只是一段人工合成的堿基序列，在探針上連接一些

可檢測(cè)的物質(zhì)，根據(jù)堿基互補(bǔ)的原理，利用基因探針到基因混合物中識(shí)別特定基因。它將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷?，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來(lái)進(jìn)行分析。基因芯片通過(guò)應(yīng)用平面微細(xì)加工技術(shù)和超分子自組裝技術(shù)，把大量分子檢測(cè)單元集成在一個(gè)微小的固體基片表面，可同時(shí)對(duì)大量的核酸和蛋白質(zhì)等生物分子實(shí)現(xiàn)高效、快速、低成本的檢測(cè)和分析。

由于尚未形成主流技術(shù)，生物芯片的形式非常多，以基質(zhì)材料分，有尼龍膜、玻璃片、塑料、硅膠晶片、微型磁珠等；以所檢測(cè)的生物信號(hào)種類分，有核酸、蛋白質(zhì)、生物組織碎片甚至完整的活細(xì)胞；按工作原理分類，有雜交型、合成型、連接型、親和識(shí)別型等。由于生物芯片概念是隨著人類基因組的發(fā)展一起建立起來(lái)的，所以至今為止生物信號(hào)平行分析最成功的形式是以一種尼龍膜為基質(zhì)的“cDNA陣列”，用于檢測(cè)生物樣品中基因表達(dá)譜的改變。

基因芯片的分類

目前已有多種方法可以將寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上。這些方法總體上有兩種，即原位合成（ in situ synthesis ）與合成點(diǎn)樣兩種。支持物有多種如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等，但需經(jīng)特殊處理。作原位合成的支持物在聚合反應(yīng)前要先使其表面衍生出羥基或氨基（視所要固定的分子為核酸或寡肽而定）并與保護(hù)基建立共價(jià)連接；作點(diǎn)樣用的支持物為使其表面帶上正電荷以吸附帶負(fù)電荷的探針?lè)肿?，通常需包被以氨基硅烷或多聚賴氨酸等?

原位合成法主要為光引導(dǎo)聚合技術(shù)（ Light-directed synthesis ），它不僅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引導(dǎo)聚合技術(shù)是照相平板印刷技術(shù)（ photolithography ）與傳統(tǒng)的核酸、多肽固相合成技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。半導(dǎo)體技術(shù)中曾使用照相平板技術(shù)法在半導(dǎo)體硅片上制作微型電子線路。固相合成技術(shù)是當(dāng)前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技術(shù)成熟且已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。二者的結(jié)合為合成高密度核酸探針及短肽陣列提供了一條快捷的途徑。

以合成寡核苷酸探針為例，該技術(shù)主要步驟為：首先使支持物羥基化，并用光敏保護(hù)基團(tuán)將其保護(hù)起來(lái)。每次選取擇適當(dāng)?shù)谋喂饽ぃ?mask ）使需要聚合的部位透光，其它部們不透光。這樣，光通過(guò)蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羥基解保護(hù)。因?yàn)楹铣伤玫膯误w分子一端按傳統(tǒng)固相合成方法活化，另一端受光敏保護(hù)基的保護(hù)，所以發(fā)生偶聯(lián)的部位反應(yīng)后仍舊帶有光敏保護(hù)基團(tuán)。因此，每次通過(guò)控制蔽光膜的圖案（透光與不透光）決定哪些區(qū)域應(yīng)被活化，以及所用單體的種類和反應(yīng)次序就可以實(shí)現(xiàn)在待定位點(diǎn)合成大量預(yù)定序列寡聚體的目的。

該方法的主要優(yōu)點(diǎn)是可以用很少的步驟合成極其大量的探針陣列。例如，合成 48 （ 65536 ） 個(gè)探針的 8 聚體寡核苷酸序列僅需 4 × 8=32 步操作， 8 小時(shí)就可以完成。而如果用傳統(tǒng)方法合成然后點(diǎn)樣，那么工作量的巨大將是不可思議的。同時(shí)，用該方法合成的探針陣列密度可高達(dá)到 106/cm2 。不過(guò)，盡管該方法看來(lái)比較簡(jiǎn)單，實(shí)際上并非如此。主要原因是，合成反應(yīng)每步產(chǎn)率比較低，不到 95% 。而通常固相合成反應(yīng)每步的產(chǎn)率在 99% 以上。因此，探針的長(zhǎng)度受到了限制。而且由于每步去保護(hù)不很徹底，致使雜交信號(hào)比較模糊，信噪比降低。為此有人將光引導(dǎo)合成技術(shù)與半異體工業(yè)所用的光敏抗蝕技術(shù)相結(jié)合，以酸作為去保護(hù)劑，使每步產(chǎn)率增加到 98% 。原因是光敏抗蝕劑的解離對(duì)照度的依賴是非線性的，當(dāng)照度達(dá)到特定的閾值以上保護(hù)劑就會(huì)解離。所以，該方法同時(shí)也解決了由于蔽光膜透光孔間距離縮小而引起的光衍射問(wèn)題，有效地提高了聚合點(diǎn)陣的密度。另?yè)?jù)報(bào)導(dǎo) ，利用波長(zhǎng)更短的物質(zhì)波如電子射線去除保護(hù)可使點(diǎn)陣密度達(dá)到 1010/cm2 。

除了光引導(dǎo)原位合成技術(shù)外，有的公司如美國(guó) Incyte Pharmaceuticals 等使用壓電打印法 (Piezoelectric printing) 進(jìn)行原位合成。其裝置與普通的彩色噴墨打印機(jī)并無(wú)兩樣，所用技術(shù)也是常規(guī)的固相合成方法。做法是將墨盒中的墨汁分別用四種堿基合成試劑所替代，支持物經(jīng)過(guò)包被后，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制噴墨打印機(jī)將特定種類的試劑噴灑到預(yù)定的區(qū)域上。沖洗、去保護(hù)、偶聯(lián)等則同于一般的固相原位合成技術(shù)。如此類推，可以合成出長(zhǎng)度為 40 到 50 個(gè)堿基的探針，每步產(chǎn)率也較前述方法為高，可達(dá)到 99% 以上。

盡管如此，通常原位合成方法仍然比較復(fù)雜，除了在基因芯片研究方面享有盛譽(yù)的 Affymetrix 等公司使用該技術(shù)合成探針外，其它中小型公司大多使用合成點(diǎn)樣法。

后一方法在多聚物的設(shè)計(jì)方面與前者相似，合成工作用傳統(tǒng)的 DNA 或多肽固相合成儀以完成，只是合成后用特殊的自動(dòng)化微量點(diǎn)樣裝置將其以比較高的密度涂布于硝酸纖維膜、尼龍膜或玻片上。支持物應(yīng)事先進(jìn)行特定處理，例如包被以帶正電荷的多聚賴酸或氨基硅烷?，F(xiàn)在已有比較成型的點(diǎn)樣裝置出售，如美國(guó) Biodot 公司的點(diǎn)膜產(chǎn)品以及 Cartesian Technologies 公司的 PixSys NQ/PA 系列產(chǎn)品。前者產(chǎn)生的點(diǎn)陣密度可以達(dá)到 400/cm2 ，后者則可達(dá)到 2500/cm2 。